曾梦颖1，闫晓霞1，刘欢欢1，汪登如1，严玉霖1
(1.云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明，650201；2.昆明爱美森宠物医院，云南昆明，650224)
摘要：本研究探讨同源异体骨髓间充质干细胞(BMMSCs)移植对犬急性肝功能损伤的治疗作用，为犬干细胞治疗相关疾病提供理论基础和技术支持。对患急性肝损伤的10只病犬经超声引导腹腔内肝门附近移植BMMSCs，移植后检测肝功能和肝脏B超，观察同期的症状体征和不良反应情况。结果显示，干细胞移植7天后可使患犬各项肝功能指标明显改善，10天后B超结果显示肝组织回声均匀，无明显异常，14天后患犬的精神、体力、食欲明显好转，21天后基本康复，移植干细胞的患犬均未发现有不良反应。结果表明相对于常规治疗，犬BMMSCs异体移植治疗急性肝损伤可明显缩短治疗时间，显著提高患犬生活质量，安全有效且副作用小，值得深入研究和临床推广。
关键词：犬骨髓间充质干细胞；异体移植；肝功能损伤
Treatment for dogs with acute liver injury by transplantation of allogeneic bone marrow mesenchymal stem cells
ZENG Mengying1, YAN Xiaoxia1, LIU Huanhuan1, WANG Dengru2, YAN Yulin1*
(1.College of Animal Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming, 650201; 2. Kunming Amth Pet Hospital, Kunming, 650224)
Abstract: This study was designed to investigate the allogeneic bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSCs) transplantation for treatment canine acute hepatic injury, which provided a theoretical basis and technical support for the clinical application of canine Stem cell transplantation. The canine BMMSCs were transplanted to treat acute liver injury of 10 dogs by ultrasound-guided near hepatic portal in abdomen, the liver function, liver B ultrasound, simultaneous symptoms and adverse reactions were observed after transplantation. The results showed that various liver function index were ameliorated significantly after 7 days transplantation, B ultrasound showed that liver tissue echo uniform, no obvious abnormalities after 10 days, the spirit, strength, appetite of dogs were improved evidently after 14 days, all dogs were recovered after 21 days and no adverse reaction were observed. Compared to the conventional treatment, the results indicated that canine BMMSCs allogeneic transplantation for treatment canine acute liver injury in dogs was safe and effective and no side effects, and could enhanced the dog’s life quality significantly, which worthy of further research and clinical practice.
Keywords: canine bone marrow mesenchymal stem cells; allogeneic transplantation; liver injury
急性肝功能损伤是指各种原因引起的肝脏功能的异常，如病毒、生物、药物、理化等。急性肝损伤可导致肝性脑病，肝肾综合征等，严重感染者会引起多器官衰竭，甚至死亡[1]。目前原位肝移植是治疗急性肝功能衰竭最有效的方法，但由于费用高，供肝紧缺等问题，原位肝移植尚未能获得广泛应用[2]。因此如何改善肝病患者/患犬的肝脏功能成为了临床研究的难点和重点。研究表明在肝损伤及肝细胞再生的过程中，干细胞(Stem Cell)起着重要的作用。干细胞是一类具有自我复制能力和多向分化潜能的细胞，具有再生各种组织器官的潜在功能，医学界称为“万用细胞”或“种子细胞”，在一定条件下，它可以定殖于受损的组织器官并分化成多种功能细胞。骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells, BMMSCs）除了能够自我更新和具有多向分化潜能外，在适宜的条件下可被诱导分化成各种组织细胞，包括肝细胞、心肌细胞、骨细胞等，参与相关组织器官的修复与重建。此外，BMMSCs还具有基质细胞的特性，能够分泌各种细胞因子，诱导机体自身干细胞至受损部位进行修复和重建。
本研究应用健康犬的骨髓间充质干细胞作为供体，在体外分离纯化后移植到病犬肝内，使干细胞在肝脏中生长分化为具有功能的肝细胞，使损伤的肝功能得以修复和重建，为犬肝病的治疗开辟崭新的途径。
1、材料与方法
1.1病例选择 10只不同品种急性肝损伤的病犬来源于昆明爱美森宠物医院，其中8只病犬是由药物或食物中毒引起，2只是灭鼠药中毒引起。病犬入院前均出现呕吐，腹泻，疼痛性呻吟的情况，入院后精神极度沉郁，弓背，皮肤松弛，鼻镜干燥，下颌淋巴结肿大，口色黏膜干燥无津液，腹部触诊紧张，前腹部触诊疼痛敏感，轻度心律不齐，肠音增强，B超检查结果（图1）显示肝脏组织回声增强，不规则团块状强回声，包膜回声增强，诊断为急性中毒性肝炎肝损伤。
1.2治疗原发病 药物中毒的患犬立即停止服用损伤肝脏功能的药物，鼠药中毒的患犬进行催吐、洗胃、导泻和利尿的处理，同时注射保肝利胆的药物，如：水飞蓟、谷光氨肽、VE，秋水仙素等，增强肝脏解毒功能。
1.2 犬骨髓间充质干细胞 云南农业大学动物病理教研室分离培养，经纯化鉴定后液氮保存。
1.3骨髓间充质干细胞移植 BMMSCs在37℃复苏后1500rmp/min离心10min，弃掉上清，用注射用生理盐水1ml稀释，超声引导腹腔内肝门附近注射移植干细胞，剂量:每次BMMSCs含量为1x 107-108个/mL，隔天进行一次BMMSCs移植。3次/疗程。
1.4肝功能检测 病犬在移植后不同时间，进行肝功能检测，分别检测谷丙转氨酶（Alanine aminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（Aspartate transaminase，AST）、碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALKP）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）等指标，并在干细胞移植后第10天进行B超检查。
1.5统计学处理 采用SPSS13.0软件，数据以均数±标准差(x±s)表示，比较采用配对t检验，P <0.05为差异有统计学意义。
2、结果
2.1症状改善程度 干细胞移植7天后，所有病犬不再出现呕吐、腹泻等症状，精神、体力、食欲明显好转。移植14天后，所有病犬精神、体力、食欲恢复正常。移植21天后基本康复。临床体征观察所有接受干细胞移植的患犬均未出现过敏、免疫排斥等不良反应。
2.2干细胞移植后ALT、AST、ALKP、LDH诸指标的改变情况 ALT于干细胞移植7天后持续下降，21天后恢复到正常水平，较移植前差异有统计学意义（P值均<0.05）。ALKP于干细胞移植前后无明显变化。AST于移植后7天显著下降并恢复到正常水平，较移植前差异有统计学意义（P值均<0.05）。LDH于移植后14天略微下降，21天则明显下降恢复到正常水平，较移植前差异有统计学意义（P值均<0.05）。（表1）
表1患犬治疗前及治疗后不同时间各指标的变化
Tab. 1 Clinical biochemical indexes prior to and following transplantation of dogs
注：除ALKP外，其它指标与治疗前相比P值均<0.05
2.3肝脏B超检查结果
干细胞移植前，B超结果显示，肝脏组织回声增强，不规则团块状强回声，包膜回声增强(图1)，干细胞移植后第10天B超结果显示肝组织回声均匀，无明显异常(图2)。
图1 干细胞移植前B超检查结果
Fig. 1 B ultrasonic examination results before stem cell transplantation
图2干细胞移植10天后B超检查结果
Fig. 1 B ultrasonic examination results after stem cell transplantation 10 days
3讨论
肝损伤是多因素引起的复杂的病理过程，肝脏是机体的重要器官，有解毒、防御、合成糖原的功能，同时也是合成多种酶的重要器官。干细胞分化为具有功能的组织细胞并应用于器官损伤的治疗，是人们关注的热点及追求的目标[6-7]，近年来干细胞移植治疗终末期肝病取得了突飞猛进的发展，但是，兽医临床上对治疗犬肝病的研究很少。本研究首次采用超声引导腹腔内肝门附近注射移植干细胞的方法对患有急性肝功能损伤的病犬进行治疗。由肝脏合成的、能够直接反应犬肝功能变化的指标主要ALT和AST两种，正常情况下，这两种酶是存在于细胞内的，只有当肝脏受到损伤，才会导致血清中这两种酶含量的升高， ALKP和LDH也是评价肝细胞损伤的指标。干细胞移植后结果显示病犬临床症状明显改善，在精神、体力、食欲方面明显好转，肝功能表现为移植后ALT、LDH持续下降，AST显著下降后会有略微升高，最后恢复到正常值，ALKP在移植后14天略微升高，但在21天后又恢复到正常水平。干细胞移植后在前期急性炎症期效果不明显，7天以后效果非常显著，说明干细胞对肝脏的再生修复需要一定的时间。相比传统治疗方法，干细胞移植显示出了强大的优势，治愈疗程明显缩短，显著地提高了患犬的生活质量，且无任何不良反应。
BMMSCs移植治疗肝损伤的动物实验报道较多[8-10]，有学者认为肝细胞凋亡是急性肝损伤的一个特征，越来越多的证据表明肝细胞凋亡在暴发性肝衰竭的发病机理中起着主导作用[11]。目前普遍认为干细胞治疗肝损伤的机制是BMMSCs通过自分泌和旁分泌作用，分泌多种细胞因子和生长因子，对肝损伤的免疫调节、抑制炎症反应、减少氧化应激损伤、支持肝细胞功能、促进肝细胞再生 、抑制肝细胞凋亡、抗纤维化等多种治疗效应都起着复杂的生物学作用，其具体的作用机制尚需进一步证实[12,13]。王方等研究者研究了不同的骨髓干细胞移植途径对急性肝功能损伤大鼠的治疗作用，研究者比较了肝门静脉移植和肝实质内移植干细胞两种方式，结果表明肝实质内移植比肝门静脉移植更有利于血清白蛋白的恢复，统计学处理有显著性差异[14]。本研究选取腹腔内肝门附近注射移植干细胞作为治疗犬急性肝功能损伤是一种新的尝试，对于肝脏的外源机械性损伤较小。目前，干细胞移植治疗肝病在人医领域的应用较多，研究表明，干细胞移植不仅可以应用于治疗肝功能损伤，还可用于治疗其它肝病。乔飞等研究者采用肝动脉插管注入脐带血干细胞治疗肝硬化失代偿期患者，16例患者中有14例患者腹水消失，2例患者较治疗前腹水明显减少，11例患者肝脏体积有所增加，平均增幅为9.7%[15]。姚鹏等研究者在X射线的监视下，采用肝动脉插管移植自体骨髓干细胞的方式治疗慢性重症肝病60例，移植后12周内的生存率为95%[16]。何金秋等研究者在数字减影血管造影下经肝动脉插管移植自体骨髓干细胞治疗终末期肝病39例，移植后8周有37例患者的肝功能恢复正常，且临床症状明显改善[17]。
本研究表明同种异体移植犬干细胞用于治疗犬急性肝损伤是安全有效可行的，并且具有巨大的临床应用前景。干细胞移植将为犬肝病的治疗开辟崭新的途径，可显著提高患犬的生活质量，相信在不久的将来，随着犬干细胞研究不断地深入，干细胞必将在犬肝病的治疗中发挥着重要的作用。
参考文献：
[1] Bernal W, Auzinger G, Dhawan A, Wendon J. Acute liver failure. Lancet. 2010;376:190–201.
[2] Pai M. Zacharoulis D. Milicevic MN, et al. Autologous infusion of expanded molbilized adult bone marrow-derived CD34 cells into Patients with alcoholic liver cirrhosis [J]. Am JGastroenterol 2008 30 (7):30-33.
[3] Cantz T. Sharma AD. Jochheim-Riichter A, et al. RevaLuation of bone/narrow-derived cells as a source for hepatocyte regeneration[J].Cell Transplant. 2004. 13 (6):659一66.
[4] Wollert KC, Meyer GP, Lotz J, et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomised controlled clinical trial. Lancet. 2004;364(9429): 141一148
[5] Kania G, Blyszczuk P, Jochheim A,et al. Generation of glycogen-and albumin-producing hepatocyte-like cells from embryonic stem ce11s.Bio1 Chem.2004.385(10):943一953
[6] Xu-Bo Wu Department of General Surgery,Central Hospital of Minhang District,Ruijin Medical Group,Shanghai 201199,China;Ran Tao Center for Organ Transplantation,Department of General Surgery,Ruijin Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200025,China. Hepatocyte differentiation of mesenchymal stem cells[J]. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 2012(04)
[7] Guangxin Jin,Gongcai Qiu,Dequan Wu,Yanhua Hu,Pengfei Qiao,Chengjuan Fan,Feng Gao. Allogeneic bone marrow-derived mesenchymal stem cells attenuate hepaticischemia-reperfusion injury by suppressing oxidative stress and inhibiting apoptosisin rats[J]. International Journal of Molecular Medicine . 2013 (6)
[8] Li, Dong-liang,He, Xiu-hua,Zhang, Shi-an,Fang, Jian,Chen, Feng-sui,Fan, Jing-jing. Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells Promote Hepatic Regeneration after Partial Hepatectomy in Rats[J]. Pathobiology . 2013 (5)
[9] Yuan S, Jiang T, Sun L, Zheng R, Ahat N, Zhang Y. The role of bone marrow mesenchymal stem cells in the treatment of acute liver failure. Biomed Res Int. 2013;2013:251846.
[10] Owen A, Newsome PN.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. Mesenchymal stromal cell therapy in liver disease: opportunities and lessons to be learnt?2015 Nov 15;309(10):G791-800. doi: 10.1152/ajpgi.00036.2015. Epub 2015 Aug 27. Review.
[11] Guicciardi ME, Malhi H, Mott JL, Gores GJ. Apoptosis and necrosis in the liver. Compr Physiol.2013;3:977–1010.
[12] Mohamed HE, Elswefy SE, Rashed LA, Younis NN, Shaheen MA, Ghanim AM.Exp Biol Med (Maywood).Bone marrow-derived mesenchymal stem cells effectively regenerate fibrotic liver in bile duct ligation rat model. 2016 Mar;241(6):581-91. doi: 10.1177/1535370215627219. Epub 2016 Jan 24.
[13] Li J, Zhang L, Xin J, Jiang L, Li J, Zhang T, Jin L, Li J, Zhou P, Hao S, Cao H, Li L. Immediate intraportal transplantation of human bone marrow mesenchymal stem cells prevents death from fulminant hepatic failure in pigs. Hepatology. 2012;56:1044–1052.
[14]王方,周一鸣,张小岗,张静. 骨髓干细胞移植对急性肝功能损伤大鼠治疗的实验研究[J]. 西北国防医学杂志,2010,01:40-42.
[15] 乔飞,张馨,盛云峰,耿家宝,陈小军,钟晶,赵颖,隋云华,何长伦,高蕾,汪茂荣. 脐带血干细胞治疗肝硬化失代偿期疗效观察[J]. 中国肝脏病杂志(电子版),2011,02:10-13.
[16] 姚鹏,胡大荣,王帅,闻炜,周一鸣,龚丽娟. 自体骨髓干细胞移植治疗慢性重症肝病60例[J]. 实用医学杂志,2005,19:44-46.
[17] 何金秋,潘兴南,王崇国,杨文龙,熊墨龙,涂鸣汉,熊志群,杨玲玲. 自体骨髓间充质干细胞移植治疗终末期肝病39例[J]. 中国组织工程研究与临床康复,2010,45:8521-8525.
